К 22 июня 1941 года в крепости дислоцировалось 8 стрелковых батальонов и 1 разведывательный, 1 артиллерийский полк и 2 артиллерийских дивизиона (ПТО и ПВО), некоторые спецподразделения стрелковых полков и подразделения корпусных частей, сборы приписного состава 6-й Орловской и 42-й стрелковой дивизий 28-го стрелкового корпуса 4-й армии, подразделения 17-го Краснознаменного Брестского пограничного отряда, 33-го отдельного инженерного полка, часть 132-го батальона конвойных войск НКВД, штабы частей (штабы дивизий и 28-го стрелкового корпуса располагались в Бресте), всего 7-8 тысяч человек, не считая членов семей (300 семей военнослужащих).

С немецкой стороны штурм крепости был поручен,под командованием генерала бронетанковых войск Германии Гейнца Гудериана, 45-й пехотной дивизии (около 17 тысяч человек), во взаимодействии с частями соседних соединений (31-я пехотной и 34-й пехотных дивизий 12-го армейского корпуса 4-й немецкой армии, а также 2 танковые дивизии 2-й танковой группы. По плану, крепостью следовало овладеть к 12 часам первого дня войны
22 июня в 3:15 по крепости был открыт ураганный артиллерийский огонь, заставший гарнизон врасплох. В результате были уничтожены склады, водопровод, прервана связь, нанесены крупные потери гарнизону. В 3:45 начался штурм. Неожиданность атаки привела к тому, что единого скоординированного сопротивления гарнизон оказать не смог и был разбит на несколько отдельных очагов. Сильное сопротивление немцы встретили на Тереспольском укреплении, где дело доходило до штыковых атак, и особенно на Кобринском, в итоге продержавшемся долее всего; более слабое — на Волынском, где находился главным образом госпиталь. Примерно половина гарнизона с частью техники сумела покинуть крепость и соединиться со своими частями; к 9 часам утра крепость с остававшимися в ней 3,5-4 тысячами человек была окружена. Немцы ставили своей целью прежде всего Цитадель и довольно быстро сумели ворваться в нее через мост от Тереспольского укрепления, заняв господствующее над крепостью здание клуба (бывшая церковь). Однако гарнизон перешёл в контратаку, отбил попытки немцев овладеть Холмскими и Брестскими воротами (соединяющими Цитадель соответственно с Волынским и Кобринским укреплениями)